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Calculadora de ligación de ADN

Calcula la masa de ADN inserto necesaria para una reacción de ligación a partir de la masa del vector, el tamaño del vector, el tamaño del inserto y la razón molar objetivo.

Preguntas frecuentes

¿Por qué importa la razón molar para la ligación de ADN?

Un exceso molar de inserto sobre vector empuja la reacción hacia la incorporación del inserto. Una razón molar 3:1 (inserto:vector) es estándar para ligaciones de extremos cohesivos; las de extremos romos suelen necesitar 5:1 a 10:1 para una eficiencia aceptable.

¿Cómo calculo la masa de inserto para la ligación?

Masa de inserto (ng) = masa de vector (ng) × (tamaño del inserto en pb / tamaño del vector en pb) × razón molar. Por ejemplo: 50 ng de un vector de 3,000 pb ligando un inserto de 500 pb a 3:1 requieren 50 × (500/3000) × 3 = 25 ng de inserto.

¿Qué temperatura y tiempo debo usar para la ligación?

La T4 DNA ligase funciona bien a 16 °C durante toda la noche o a 25 °C por 1 hora para extremos cohesivos. Los protocolos de quick-ligase usan temperatura ambiente por 5 a 15 minutos. Las ligaciones de extremos romos generalmente requieren tiempos de reacción más largos y mayor concentración de enzima.

¿Cómo convierto la masa de inserto en un volumen para pipetear?

Divide la masa que necesitas entre la concentración de tu reserva (stock) de inserto: volumen (µL) = masa (ng) / concentración (ng/µL). Por ejemplo, si la calculadora indica que necesitas 25 ng de inserto y tu stock marca 20 ng/µL, añade 25 / 20 = 1.25 µL. Haz lo mismo con el vector y luego completa la reacción hasta su volumen final con ligasa, buffer y agua.

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Estimaciones solo con fines informativos.

Aviso importante: Estimaciones solo con fines informativos.

Esta calculadora ofrece estimaciones con fines informativos. Los resultados se basan en supuestos y pueden no reflejar resultados reales. Consulta a profesionales calificados en las áreas correspondientes antes de tomar decisiones importantes basadas en estos resultados.

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Cómo funciona esta calculadora

Una reacción de ligación une un vector de ADN a un fragmento inserto usando la enzima ADN ligasa. Para una ligación eficiente, las cantidades molares de inserto y vector deben estar en una razón controlada. Como la cantidad molar depende tanto de la masa como de la longitud, no basta con añadir masas iguales de cada fragmento.

Esta calculadora convierte entre masa y cantidad molar usando la relación de que cualquier fragmento de ADN de doble hebra tiene un peso molecular proporcional a su longitud en pares de bases. Por eso, la masa de inserto necesaria es proporcional a la masa del vector, escalada por la razón de sus longitudes y multiplicada por la razón molar objetivo.

Fórmula

La fórmula estándar de ligación es:

Masa de inserto (ng) = Masa de vector (ng) × (Tamaño del inserto en pb / Tamaño del vector en pb) × Razón molar

Este reordenamiento viene de la definición de razón molar: moles de inserto entre moles de vector, donde los moles equivalen a la masa entre el peso molecular y el peso molecular es proporcional al tamaño en pares de bases para ADN lineal de doble hebra.

Guía de razones molares

La razón molar inserto:vector que elijas depende de la estrategia de ligación:

1:1 - Control de autoligación. Se usa para medir el fondo de recircularización del vector, que se minimiza desfosforilando los fosfatos 5' del vector con una fosfatasa como CIP o rSAP. Sin esos fosfatos 5', los extremos cortados del vector no pueden ligarse entre sí, de modo que un vector bien desfosforilado muestra muy pocas colonias en este control.
3:1 - Razón estándar para ligaciones con extremos cohesivos (sticky ends). Da suficiente exceso de inserto para impulsar la ligación sin generar concatémeros con varios insertos.
5:1 - Útil cuando la eficiencia de ligación es menor a la esperada o cuando el inserto es pequeño comparado con el vector.
7:1 a 10:1 - Recomendada para ligaciones de extremos romos (blunt ends), que son mucho menos eficientes que las de extremos cohesivos porque los extremos no se aparean para mantenerse alineados.

Ejemplo resuelto

Tienes 50 ng de un vector de 3,000 pb y quieres ligar un inserto de 500 pb en una razón molar 3:1.

Masa de inserto = 50 × (500 / 3000) × 3 = 50 × 0.1667 × 3 = 25 ng

La razón real de masas es 25 / 50 = 0.5, lo que significa que añades la mitad de inserto por masa que de vector. A pesar de la menor masa, el exceso molar es 3:1 porque el inserto es seis veces más corto que el vector.

Errores comunes

Añadir masas iguales de inserto y vector. Para un inserto de 500 pb y un vector de 3,000 pb esto da un exceso molar de 6:1, produciendo concatémeros y muy pocos clones correctos con inserto único.
Usar la longitud total del plásmido en lugar de la longitud del vector linealizado. El tamaño del vector debe ser la longitud tras la digestión con enzimas de restricción, no el tamaño original del plásmido circular.
Olvidar desfosforilar el vector para clonación de inserto único. Sin ello, el fondo del vector recircularizado opacará la señal.
Calcular la masa de inserto pero no tener en cuenta el volumen de la reserva (stock) de inserto. Divide la masa necesaria entre la concentración para obtener el volumen a añadir.
Usar la misma razón para ligaciones de extremos romos y cohesivos. Los extremos romos requieren una razón mayor (7:1 a 10:1) para compensar la menor eficiencia.

Consejos y preguntas frecuentes

P: ¿Cuánto ADN total conviene para una ligación? La mayoría de los protocolos de T4 DNA Ligase piden de 50 a 100 ng de ADN total en una reacción de 10 a 20 μL. Usa esta calculadora para hallar la masa de inserto y luego suma la masa del vector para revisar que el total se quede en ese rango.

P: ¿Importa el tamaño del fragmento más allá del cálculo de la razón? Sí. Los insertos muy pequeños (menores de 200 pb) ligan con poca eficiencia y pueden requerir condiciones optimizadas como PEG 4000, una razón molar más alta o usar Gibson Assembly en su lugar.

P: ¿Cuánto tiempo debo ligar? Las ligaciones de extremos cohesivos suelen ser de 10 a 16 horas a 16 °C o 10 minutos a temperatura ambiente con una ligasa rápida. Las ligaciones de extremos romos se benefician de incubación más larga a 16 °C.

P: ¿Puedo usar esta fórmula para Golden Gate o Gibson Assembly? Esos métodos usan equivalentes molares directamente. Esta calculadora te da la masa de inserto a partir de la razón molar, lo cual sigue siendo útil para preparar mezclas equimolares (pools), pero consulta tu protocolo específico para las razones recomendadas.